Florey syntyi Adelaidessa Etelä-Australiassa koulun rehtorin pojaksi. Hän opiskeli St Peter's Collegessa Adelaidessa ja Adelaiden yliopistossa, jossa hän valmistui kandidaatin tutkinnosta vuonna 1921 ja lääketieteen tohtorin tutkinnosta vuonna 1924.
Valmistuttuaan lääketieteen tutkinnon Florey työskenteli Walter ja Eliza Hall Institute of Medical Researchissa Melbournessa, missä hän tapasi Ernst Chainin. Vuonna 1928 he muuttivat Oxfordin yliopiston Sir William Dunnin patologian kouluun, jossa he aloittivat työskentelyn penisilliinin kehittämisen parissa.
Alexander Fleming löysi penisilliinin vuonna 1928, mutta sitä ei ollut kehitetty käyttökelpoiseksi lääkkeeksi. Florey ja Chain onnistuivat eristämään penisilliinin vaikuttavan aineen ja puhdistamaan sen niin, että se voitiin ruiskuttaa potilaisiin. He kehittivät myös menetelmiä penisilliinin massatuotantoon, mikä mahdollisti sen laajan käytön toisen maailmansodan aikana.
Floreyn ja Chainin työ penisilliinistä pelasti lukemattomia ihmishenkiä toisen maailmansodan aikana ja mullisti tartuntatautien hoidon. Floreylle myönnettiin Nobelin fysiologian tai lääketieteen palkinto vuonna 1945, ja hänet valittiin ritariksi vuonna 1944.
Florey oli myös arvostettu ylläpitäjä ja kouluttaja. Hän toimi Oxfordin yliopiston varakanslerina vuosina 1959–1962 ja Lontoon kuninkaallisen seuran puheenjohtajana vuosina 1960–1965. Hän oli myös Australian Academy of Sciencen ja American Academy of Arts and Sciences -akatemian jäsen. ja National Academy of Sciences.
Florey kuoli aivohalvaukseen Oxfordissa vuonna 1968. Häntä pidetään yhtenä 1900-luvun tärkeimmistä australialaisista tiedemiehistä, ja hänen penisilliinityönsä on pelastanut miljoonia ihmishenkiä.